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    原生质体叶肉细胞瞬时表达实验步骤

    更新时间:2023-05-18点击次数:1202

    原生质体叶肉细胞瞬时表达实验步骤
    1、生长培养好的试验材料(一般为生长20天左右的拟南芥幼苗叶片)
    2、在拟南芥开花前取样(30片叶子左右即可)
    3、切取叶片为0.5-1mm的细条(如果材料能达到每克107个原生质体,10-20片叶子需要5-10mL酶解液)
    4、迅速将切下的样品转到酶解液中,要求浸没。
    5、黑暗条件下抽真空30min。
    6、连续酶解,室温下23℃黑暗中静止酶解3h
    7、利用光学显微镜检查原生质体(30-50μm大?。?/span>
    8、在过滤前加入等量的W5溶液
    9、洗干净滤网,并用W5润湿,之后过滤
    10、离心100g,1-2min沉淀原生质体,尽可能吸走上清,重复洗2次
    11、重悬原生质体于W5中,保持在2*105个/ml,冰浴30min。
    12、100g离心2min,尽可能吸走上清,利用MMG重悬,浓度约2*105个/ml
    13、加入10μL质粒(1000ng-2000ng)于2ml离心管中
    14、加入100μL原生质体(2*104个),轻轻混匀。
    15、加110μL PEG solution,轻弹使充分混匀
    16、23℃室温孵育30min。
    17、加400-440μL W5混匀,终止反应
    18、100g,2min 23℃离心,去上清,重复洗一次
    19、用1mL W5重悬原生质体并放入6孔板中培养
    20、20-25℃孵育16h以上
    21、取样制片观察
     
    溶液配制:
    1、酶解液的配制(20ml)试剂终浓度质量/g

    试剂终浓度质量/g
    MES20mM0.08528KOH调pH5.7
    D-Mannitol0.4M1.45736
    KCl20mM0.02982
    macerozyme R-100.40%0.08
    Cellulase R-101.50%0.3
    55℃水浴10min,待冷却后再加以下试剂
    CaCl2·2H2O10mM0.029402
    BSA0.10%0.02

    W5溶液配制(500mL)

    试剂终浓度质量/g
    MES2mM0.19524KOH调pH5.7
    NaCl154mM4.49988
    CaCl2·2H2O125mM9.18825
    KCl5mM0.186375

    MMG配制(100mL)

    试剂终浓度质量/g
    MES4mM0.078096KOH调pH5.7
    D-Mannitol0.4M7.2868
    MgCl2·6H2O15mM0.30495

    PEG配制(10mL)

    试剂终浓度质量/g
    PEG 400040%4
    D-Mannitol0.2M0.36434
    CaCl2·2H2O100mM0.14701


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