X-射线衍射法

X-射线衍射技术是鉴定蛋?质结构的?标准。XRD可以实现较?的分辨率，通?？梢源锏?到2埃。因此，它可以提供?常详细的原?级别的结构信息。然?蛋?质晶体的??对XRD来说是?个很?的挑战，因为不是所有蛋?质都能够形成?质量的结晶。对于难以结晶的蛋?质，获得合适的晶体可能需要花费?量时间和努?。这也就是为什么当科学家解析出?个新的蛋?质结构通常都可以发CNS的原因。

蛋?质三维结构的精度通常?“分辨率"来表示，单位为埃（?），分辨率衡量了衍射图像以及计算电?密度图时看到的细节?平。如果晶体中的所有蛋?质都以相同的?式排列，形成?个晶体，那么其中所有的蛋?质分?都会以相同的?式散射X-射线，使衍射图能够显示出晶体的精细细节。 另???，如果晶体中的蛋?质都略有不同，例如由于局部柔性或运动等产?了结构差异，衍射图案就不会包含那么多的精细的信息。分辨率值为1 ?左右的结构属于?分辨率结构，其晶体是?度有序的，因此很容易在电?密度图中看到每个原?。?分辨率?于3 ?的结构仅显示蛋?质链的基本轮廓，原?的位置只能通过推测得知。不过，?多数由XRD解析的蛋?质结构都介于这两极之间。

上图为不同分辨率下的myoglobin蛋?的电?云密度图，1.0 ?分辨率下的原?位置清晰可辨； 2.0 ?分辨率下虽然每个原?的位置已经?法清晰辨认，但氨基酸残基整体的形状仍然清晰， 可以?较准确地确定原?位置；当分辨率来到2.7 ?，氨基酸残基的形状已经变得模糊，准确 推断原?位置具有较?困难；对于3.0 ?分辨率的结构，?乎?法从电?云密度图辨认出残基 的形状，仅能看到此处有?个残基存在。读者可点击此处的链接??观察不同分辨率下的电? 云形状：1A6M（1.0 ?）、106M（2.0 ?）、108M（2.7 ?）、1S0H（3.0 ?）。

核磁共振技术

核磁共振技术通过分析蛋?质样品中的信号来解析蛋?质的结构。需要利?特定的同位素标记 ?法（如15N或13C标记）将?标蛋?质中的?部分原?标记上，再通过2D相关实验（如1H[1]15N HSQC或1H-1H COSY）确定原?间的连接关系及三维空间排布?；谑笛椴獾玫腘MR数 据，使?计算?法和算法对蛋?质的结构进?计算和模拟，如分?动?学模拟、模拟退?等得 到蛋?质的三维结构模型。

NMR的分辨率通常较低，且?般只能?来分析较?的蛋?质?段的结构，通过多次采样来得 到溶液中蛋?质的平均位置。然?，NMR对样品的要求较为灵活，可以提供有关蛋?质动态 ?为、柔性区域和构象变化的重要信息。

冷冻电?显微镜技术

冷冻电?显微镜是近年来?速发展的技术，通过观察蛋?质的冷冻样品中的电?显微图像来解析蛋?质的结构。Cryo-EM技术不需要蛋?质结晶。相反，它使?冷冻技术来固定溶液中的蛋?质构象，从?可以研究?晶态或?规则结构的蛋?质。在过去，Cryo-EM的分辨率不怎么?，通常只能达到??埃，仅能分辨出蛋?质颗粒的?致轮廓。2017年的诺?尔化学奖授予了Jacques Dubochet、Joachim Frank和Richard Henderson三位科学家，他们三者的?作极?地提?了Cryo-EM技术获得的蛋?质图像分辨率。?前，Cryo-EM技术获得的蛋?结构可达到数埃的分辨率，能够?致看出分?的轮廓与肽链?向。PDB数据库中使?Cryo-EM?法解析出的分辨率最?的蛋?质已经具有原?级的精度，分辨率达到了1.15 ?（PDBID：7A6A），不过，这些?精度的结构仅占极?的?例，?部分结构的精度还处于3-5 ?的中等分辨率下。

由于?需结晶，也不?解析复杂的核磁共振信号，Cryo-EM在?分?和超?分?的结构解析上?常有优势，如?蛋?质复合物、膜蛋?和病毒等。此外，Cryo-EM还能够提供动态过程的信息，如蛋?质的构象变化。

微晶电?衍射技术

除了以上提到的三种技术外，近年来?种新的结构解析?法——微晶电?衍射（Micro-ED）——正?速发展起来。该技术可以快速、?分辨率的测定?分?化合物和?物?分?的3D结构。其使?电?作为?射光束，在冷冻透射电镜（cryo-TEM）上获得电?衍射数据。由于Micro-ED采?电???光?作为射线，电?相?光?拥有更短的德布罗意波?，因此其与物质作?的强度更强，能够分析很?的晶体并达到很?的分辨率。通常Micro-ED只需使?约100纳?的?晶体，在?分钟内就能完成数据采集。并且数据采集过程可以直接得到电?的相位信息，??需进?相位重建。数据处理??，采?常规的XRD解析?具就能解析Micro-ED数据，这更近?步降低了其应??槛。

    不过，Micro-ED并不太适合?尺?蛋?的结构解析，其更适?于解析短肽以及?分?化合物。例如天然产物的结构解析或药品?产中对API的分析等。?2013年应?以来，已经有数百篇Micro-ED相关的论?发表。

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