在 CRISPR-Cas9 基因编辑技术中常用的分子生物学试剂有哪些?

在 CRISPR-Cas9 基因编辑技术中，常用的分子生物学试剂按实验流程可分为载体构建、gRNA 制备、细胞递送、编辑检测、筛选与修复五大核心环节，以下是常用到的生物试剂：

一、载体构建阶段

1. 限制性内切酶

作用：切割质粒载体和目的 DNA 片段，用于 gRNA 表达盒或 Cas9 表达载体的组装。

常用酶：

BsaI：识别非常规回文序列（如 GGTCTC），切割后产生黏性末端，适用于 Golden Gate 克隆法，批量组装 gRNA 表达单元（尤其适用于 CRISPR 文库构建）。

EcoRI、HindIII：传统限制性内切酶，比如百时美的EG15536S常用于质粒线性化（如 pUC19、pSpCas9 载体）。

AgeI、AscI：稀有切点酶，减少载体内部酶切位点干扰，提高克隆效率。

应用场景：载体酶切→目的片段插入→连接反应（需配合 T4 DNA 连接酶）。

2. DNA 连接酶

T4 DNA 连接酶：连接酶切后的载体与 gRNA 片段，形成重组质粒。

Gibson 组装试剂盒：基于同源重组的无缝克隆技术，无需酶切位点，直接拼接多个 DNA 片段（如 Cas9 表达盒与 gRNA 阵列）。

3. 质粒提取与纯化试剂

质粒小提试剂盒（如 Qiagen Miniprep）：从大肠杆菌中提取重组质粒，用于后续转染或测序验证。

二、gRNA 设计与制备

1. gRNA 寡核苷酸合成

DNA 寡核苷酸：合成 gRNA 的 crRNA（靶向序列）和 tracrRNA 互补链，通常含 20nt 靶向序列 + PAM 邻近序列（如 NGG）。

磷酸化试剂：如 T4 多核苷酸激酶（PNK），对寡核苷酸 5' 端磷酸化，提高连接效率。

2. 体外转录（IVT）试剂

RNA 聚合酶：如 T7 RNA 聚合酶，以 DNA 为模板转录 gRNA（需含 T7 启动子序列），适用于体外合成 sgRNA（单链 gRNA）。

RNA 纯化试剂盒（如 RNA Clean & Concentrator）：去除转录产物中的 DNA 模板和杂质，获得高纯度 sgRNA。

3. 引物与 PCR 试剂

PCR 引物：扩增 gRNA 表达盒（如 U6 启动子 + gRNA 序列），或用于载体构建中的序列验证（如菌落 PCR）。

高保真 DNA 聚合酶（如 Q5、KOD）：确保扩增序列无突变，尤其在构建 CRISPR 文库时避免靶向误差。

三、细胞递送与编辑

1. 转染试剂

脂质体转染试剂：如 Lipofectamine 3000、JetPrime，将重组质?；?nbsp;sgRNA/Cas9 核糖核蛋白（RNP）复合物导入细胞（适用于贴壁细胞，如 HEK293T、HeLa）。

电转染试剂盒：如 Nucleofector 电转仪配套试剂，适用于难转染细胞（原代细胞、免疫细胞）。

病毒包装试剂：

慢病毒包装质粒（psPAX2、pMD2.G）：包装 Cas9/gRNA 载体，感染分裂或非分裂细胞（如神经元）。

AAV 载体系统：含 AAV 反向末端重复序列（ITR）、Cas9 基因，用于体内递送（需辅助质粒 pAAV-RC、pAAV Helper）。

2. Cas9 蛋白与 RNP 复合物

重组 Cas9 蛋白：如 SpCas9-NLS（核定位信号修饰），与 sgRNA 体外组装成 RNP，瞬时转染细胞以降低脱靶风险（避免质粒整合）。

蛋白酶抑制剂：如 PMSF，在蛋白纯化过程中?；?nbsp;Cas9 不被降解。

四、编辑效率检测

1. PCR 与测序试剂

Taq PCR 试剂盒：扩增编辑位点上下游 DNA，用于 Sanger 测序（检测 Indels）或 TA 克隆后测序（分析突变频率）。

高通量测序建库试剂：如 Illumina TruSeq DNA Kit，对大量样本进行深度测序，定量脱靶效应。

2. 错配切割酶

T7E1 核酸酶/ Surveyor 核酸酶：识别编辑后 DNA 双链错配位点并切割，通过凝胶电泳检测突变效率（适用于初步筛?。?。

3. 荧光定量试剂

qPCR 试剂盒：检测报告基因（如 GFP）的表达变化，评估基因敲除 / 激活效率（需构建荧光报告载体，如 Cas9-dCas9 融合激活系统）。

五、筛选与修复过程

1. 筛选标记试剂

抗生素：如嘌呤霉素（Puro）、G418（Neomycin），筛选稳定整合 Cas9/gRNA 载体的细胞克?。ㄐ柙靥逍剐曰颍?。

流式细胞仪（FACS）：分选表达荧光标记（如 mCherry）的阳性细胞，适用于无抗生素筛选的场景。

2. HDR 供体模板

单链寡核苷酸（ssODN）：含同源臂的修复模板，用于精确基因敲入（如点突变修复），需化学合成并经 PAGE 纯化。

双链 DNA 质粒：作为 HDR 供体，携带大片段外源基因（如荧光蛋白基因），需配合 Cas9 切割诱导同源重组。

3. 碱基编辑相关试剂

脱氨酶融合蛋白：如胞嘧啶脱氨酶（APOBEC1）或腺嘌呤脱氨酶（TadA），与 Cas9n（切口酶）结合，实现单碱基编辑（如 BE3、ABE 系统），无需 DSB 即可完成 C→T 或 A→G 替换。

尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）：?；け嗉讨胁哪蜞奏げ槐恍薷?，提高碱基编辑效率（常见于胞嘧啶碱基编辑器）。

六、辅助试剂与系统优化

1. 细胞培养试剂

培养基与添加剂：如 DMEM、胎牛血清（FBS），维持细胞状态；ROCK 抑制剂（Y-27632）提高干细胞转染后的存活率。

细胞裂解液：如 RIPA 缓冲液，提取细胞蛋白用于 Western blot 检测 Cas9 表达。

2. 基因编辑工具盒

CRISPR 文库筛选试剂盒：如 Broad Institute 的 GeCKO 文库，包含靶向全基因组的 gRNA 阵列，用于功能基因筛?。ㄐ枧浜下《景笆约粒?。

CRISPR 激活 / 抑制系统：dCas9-VPR（激活）或 dCas9-KRAB（抑制）质粒，搭配 sgRNA 实现基因转录调控，需启动子区域靶向 gRNA。

试剂分类与应用流程图

实验流程                核心试剂                                  作用

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载体构建              限制性内切酶（BsaI、EcoRI）、T4连接酶        切割/连接gRNA/Cas9载体

gRNA制备             IVT试剂盒（T7聚合酶）、DNA寡核苷酸           合成sgRNA

细胞递送            转染试剂（脂质体/电转）、病毒包装质粒           导入细胞/体内递送

编辑检测            T7E1酶、PCR试剂、测序试剂盒                  评估突变效率与脱靶

筛选修复            抗生素、ssODN供体、碱基编辑器组分            筛选阳性细胞/精确修复

辅助优化            细胞培养基、CRISPR文库、蛋白酶抑制剂          系统优化与功能扩展

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实验试剂选择策略与注意事项：

递送效率：原代细胞先选电转或病毒载体，贴壁细胞可用脂质体转染。

检测精度需求：初步筛选用 T7E1 酶，精准分析需高通量测序。

修复类型选择：基因敲除依赖 NHEJ（无需供体），精确编辑需 HDR（需 ssODN/dsDNA 供体）。

安全性考量：RNP 复合物（蛋白 + sgRNA）可减少质粒整合风险，适用于医学研究。

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