细胞凋亡检测及分子生物学检测步骤

细胞凋亡检测及分子生物学检测步骤：

1、细胞DNA 含量分布（ 由细胞DNA 降解方式检测细胞凋亡） 

    收集已固定的单细胞悬液约 5× 105~1 × 106/ml；

    离心除去固定液， 3ml PBS 重悬细胞;

   使用低速离心机 1500rpm  离心， 5 分钟 ，弃去 PBS；

   加 PI 染液 1ml，室温避光 20 分钟；

   调整细胞浓度 5× 105/ml；

   上机检测。

2 、磷脂酰丝氨酸外翻分析检测细胞凋亡

1)      常 规 制 备 单 细 胞 悬 液 ,  用 PBS   洗 两 次 .(  若 为 全 血 要 先 溶  血),取约 5× 106 个细胞，1500rpm 离心,弃上清,用 400μl 1 ×Binding Buffer 重悬；

2)   分成 a 、b 、c 、d 、e 五管，每管约 1× 106 个细胞

a)    阴性对照，不加任何试剂；

b)    阳性对照,加 2%多聚甲醛固定 30 分钟,加 AnnexinV 5μl, 室温 10min , 用 1 ×Binding Buffer 洗一次,弃上清再加 190μl  缓冲液、10μl PI 避光 15 分钟

c)    加 10μl PI，避光孵育 15 分钟；

d)   加 5μl AnnexinV 液，室温避光孵育 15min；

e)    加 10μl PI 和 5μl AnnexinV 液，室温避光孵育 5min；

3)   每管各加 400μl 1 ×Binding Buffer。

4)   上机检测。

注意 a.  操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞；

b.  操作时注意避光；

c.  反应完毕后尽快检测，最好在一小时内检测。

3、用单克隆抗体 APO2.7 检测细胞凋亡

1)   放置 0.5~1× 106 个细胞到试管中；

2)    室温离心 200g ，6min；

3)    弃上清 ，加入 100μl 冷的（4℃ )在 PBSF 溶液中含 100µg/ml  的 digitonnin，轻轻地重悬细胞，在冰上孵育 20min；

4)   加入 2ml 冷的（4℃) PBSF 液，室温离心 200g ，6min；

5)    弃上清， 加入 20μl PE 标记的 Apo2.7  单克隆抗体和 80μl PBSF 液，用 vortex 轻轻震荡，室温避光孵育 15 分钟；

6)   加入 2ml PBSF 液，室温离心 200g ，6min；

7)    弃上清，加入 1ml PBSF 液重悬细胞；

8)   避光保存，直到流式细胞仪检测。

PBSF：含 2.5% FCS（v/v）和 0.01%NaN3（w/v）的 PBS。

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