双向电泳的样品的制备及电泳实验步骤

样品制备原则

样品制备是双向电泳中最关键的一步，将直接影响 2-DE 结果好坏。目前并 没有一个通用的样品制备方法， 尽管处理方法多种多样， 但都遵循几个基本的原 则： 1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的 损失； 2）减少对蛋白质的人为修饰； 3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作

用，并使蛋白质处于变性状态。

根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes), 主要包 括尿素（Urea）和硫脲（thiourea ）；表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，

如 CHAPS 与 Zwittergent 系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducing agents），常用的是二硫苏糖醇（DTT）和磷酸三丁酯（TBP）等。当然，也可以选择性 的加入 Tris-base, 蛋白酶抑制剂以及核酸酶。样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合， 以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中， 必须考虑到去除 影响蛋白质可溶性和 2DE 重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐  类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压， 甚至会损坏 IPG 胶条，这样都会造成 2-DE 的失败。样品制备的失败很难通过后

续工作的完善或改进获得补偿。

核酸的去除可采用超声或核酸酶处理， 超声处理应控制好条件， 并防止产生 泡沫； 而加入的外源核酸酶则会出现在最终的 2D 胶上。脂类和多糖都可以通过 超速离心除去。透析可以降低盐浓度， 但时间太长； 也可以采取凝胶过滤或沉淀 /重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。

因此， 样品制备方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求 来进行选择。 目前有很多方法适于 2-DE，如组织或细胞的总蛋白提取物、亚细 胞组份或细胞器蛋白、免疫沉淀的蛋白及其它亚组份蛋白（如磷酸化蛋白、 采用 亲合纯化凝集素结合蛋白等）。

一、细胞样品

1.    细胞培养，加药与处理。

2.    胰酶消化贴壁细胞， PBS 漂洗 3 次(1500g, 5min) ，弃上清,  再次离心，去 尽残液（ 非常重要?。?。如要比较细胞膜蛋白组的差别， 最好用细胞刮收获细 胞。如用 10mM Tris/ 250 mM Sucrose(pH 7.0)代替 PBS，可有效降低样品的 盐浓度。加入 5 倍体积裂解液，混匀（或将 1× 106  细胞悬于 60 ～ 100µl 裂解液 中 ）。 

3.    加 50ug/ml RNase 及 200ug/ml Dnase ，在 4℃放置 15 分钟。

4.    15,000 转， 4℃离心 60 分钟（或 40,000 转， 4℃离心 30 分钟 ）。 

5.    收集上清。

6.    测定蛋白浓度(采用 BioRad RC/DC protein assay kit)。

7.    分装样品，冻存于－70℃。

二、组织样品

1.   碾钵碾磨组织，碾至粉末状。

2.   将适量粉末状组织转移至匀浆器，加入适量裂解液，进行匀浆。

3.   加 50ug/ml RNase 及 200ug/ml DNase，在 4℃放置 15 分钟。

4.   15,000 转， 4℃离心 60 分钟（或 40,000 转， 4℃离心 30 分钟 ）。 

5.   收集上清，测定蛋白浓度。

6.    分装样品，冻存于－70℃。

注意事项：

1.   8 mmol/L PMSF 必须在添加还原剂之前用，否則 PMSF 会失去活性。 

2.  40 mmol/L 浓度以下的 Tris 可使有些蛋白酶在高 pH 值下失活。

3.   细胞清洗―― 大多用 PBS，若 PBS 残留于细胞表面会造成胶上出现水平条纹 ，

则可利用(10 mmol/LTris, 250 mmol/L sucrose pH 7.0)來解決此问题。 

双向电泳操作步骤

水化上样(被动上样)

1.    从冰箱中取出 IPG 胶条，室温放置 10min。

2.    沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品，槽两端各 1cm 左右不加样，中间 的样品液一定要连贯.注意：不要产生气泡， 否则会影响胶条中蛋白质的分布。

3.    用镊子轻轻撕去 IPG 胶条上的?；げ?。 注意：碱性端较脆弱，应小心操作。

4.    将IPG 胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上.注意:不要将样品溶液弄到 胶条背面, 因为这些溶液不会被胶条吸收;还使胶条下面的溶液产生气泡。如产 生了气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶走。

5.    放置 30~45min 大部分样品被胶条吸收， 沿着胶条缓慢加入矿物油， 每根胶条

约 3ml(17cm IPG)，防止胶条水化过程中液体蒸发。

6.    置等电聚焦仪于-20℃水化 11~15h。

一向 等电聚焦

1.    将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加 ddH2O 5~8µl 润湿。

2.    取出水化好的胶条，提起一端将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于刚好润湿 的滤纸片上杂交以去除表面上的不溶物。

3.    将 IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘中， 胶条的正极（标有+ ）对应于聚焦盘的正极，确保胶条与电极紧密接触。

4.    在每根胶条上覆盖 2-3ml 矿物油。

5.    对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。

6.    聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向 SDS-PAGE 电泳?；蚪禾踔糜谘?/p>

品水化盘中， -20℃冰箱保存， 电泳前取出胶条， 室温放置 10 分钟， 使其溶解。

第二向 SDS-PAGE 电泳

1.    配制 12%的丙烯酰胺凝胶。

2.    待凝胶凝固后， 倒去分离胶表面的 MilliQ  水、乙醇或水饱和正丁醇， 用MilliQ 水冲洗。

3.    配制胶条平衡缓冲液 I

4.    在桌上先放置干的厚滤纸， 聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另 一份厚滤纸用 MilliQ 水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸 干胶条上的矿物油及多余样品，这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。

5.    将胶条转移至样品水化盘中，加入 6ml(17cm IPG)平衡缓冲液 I，在水平摇床 上缓慢摇晃 15 分钟。

6.    配制胶条平衡缓冲液 II。

7.    第一次平衡结束后，取出胶条将之竖在滤纸上沥去多余的液体，放入平衡缓 冲液 II 中，继续在水平摇床上缓慢摇晃 15 分钟。

8.    用滤纸吸去 SDS-PAGE 胶上方玻璃板间多余的液体， 将二向凝胶放在桌面上，

凝胶的顶部面对自己。

9.    将琼脂糖封胶液加热溶解。

10.  在 100ml 量筒中加入 TGS 电泳缓冲液。

11.  第二次平衡结束后，取出胶条，用滤纸吸去多余的平衡液（将胶条竖在滤纸 上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。

12.  用镊子夹住胶条的一端使胶面全浸末在 1× 电泳缓冲液中漂洗数次。

13.  将胶条背面朝向玻璃板，轻轻放在长玻板上，加入低熔点琼脂糖封胶液。

14.  用适当厚度的胶片, 轻轻地将胶条向下推,使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面全接 触.注意:不要在胶条下方产生气泡， 应推动凝胶背面的支撑膜， 不要碰到胶面。

15.  放置 5 分钟，使低熔点琼脂糖封胶液凝固。

16.  打开二向电泳制冷仪，调温度为 15℃。

17.  将凝胶转移至电泳槽中，加入电泳缓冲液，接通电源，起始时用的低电流 （5mA~10mA/gel/17cm ），待样品在全走出 IPG 胶条， 浓缩成一条线后， 再 加 大 电流（20-30mA/gel/17cm ）待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

 18.  电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。

19.  进行染色。

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