SDS-PAGE 胶染色介绍

一、各种蛋白染色方法的灵敏度比较

二、考马斯亮蓝染色

CBB 染色液

0.5%考马斯亮蓝 G250 或 R250

40%甲醇

10%乙酸

将 CBB 溶于甲醇中并不停的搅拌 15min。加入乙酸与 ddH2O 脱色液： 30%甲醇

10%乙酸

染色方法： 1.在摇床上染色 30min.

2.脱色至蛋白点或条带清晰可见

3. ddH2O 洗 3-5 次

三、胶体考马氏亮蓝染 色 Colloidal Coomassie Staining（ Cambridge centre for porteomics ）

sensitivity = ~100ng

1.  固定：甲醇/醋酸/H2 O(45:1:54) 至少 20min.

2.  染色 12-18hr。

染色液：   17% (w/v)  硫酸铵

34%甲醇

0.5%醋酸

0.1% (w/v) Coomassie G250

3.  脱色：用 H2O 脱色至蛋白点和背景清晰.

双向电泳蛋白点的切取和保存

1.   用 PDQuest 软件或肉眼比对，找出感兴趣的蛋白点，并做好标记和记录。

2.   用 MilliQ  水冲洗胶 2 次。

3.   用色谱纯甲醇和 MilliQ  水冲洗 Ep 管

4.   将枪头(200µl)下端剪去，使其内径略小于蛋白斑点的直径，用色谱纯甲醇和 MilliQ 水冲洗枪头。

5.   对准斑点中央小心将蛋白切割下来， 放入 Ep 管，MilliQ 水漂洗 2 次， 如胶块 太大，将其切成 1 x 1 mm 的胶片。

6.   将切好的点做好标记和记录，置-80oC 保存或冻干后-20oC 存放。

注意事项：

1.   尽量避免皮肤和头发的角蛋白的污染，在操作过程中应戴一次性的 PE 手套 （不用乳胶手套）和帽子。

2.   不要将胶长期存放于乙酸溶液中。

3.   Ep 管及染胶的容器必须用甲醇和水充分清洗， 尤其应与进行 Western blotting 的容器分开，以避免 casein 或 BSA 的污染。